沈降とは, 溶液中の粒子や凝集物が重力や遠心力によって沈降する単純な物理現象です. この現象は非常に単純であるため, 毒性学, 生化学, 生物医学, 遺伝学, 製薬工学など, 多くの技術で広く利用されています. 今回のブログでは, 重力が試験管内の沈降にどのように影響するかについての数理モデルと, ナノ毒性学用の実用的なアプリを作成する方法 (様々な応用例の中の一例として) についてお話します.
粒子が試験管の底に沈降する抽出されたDNA. 画像: Isaevde (自作). CC BY-SA 4.0 でライセンス, Wikimedia Commons経由.
生物学では沈降はどのように使われているか?
2020年3月以降, 拡大する新型コロナウイルスパンデミックは, 私たちの生活に様々な影響を及ぼしています. コロナウイルスの検査技術として最も広く利用されている PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) を, 旅行前や仕事で受けた人もいるのではないでしょうか. PCR の発明者は Kary Mullis 氏とMichael Smith 氏で, 彼らはその発明で1993年にノーベル賞を受賞しています. また, ウイルスの蔓延を防ぐためにコロナウイルスワクチンが必要とされています. この mRNA を用いた SARS-CoV-2 ワクチンの技術を開発した第一人者である Drew Weissman 博士と Katalin Karikó 博士は, 2021年に米国最高の生物医学研究賞である Lasker 賞を受賞しています.
コロナ禍で, 私たちは無意識のうちに, ウイルス, ワクチン, PCR, mRNAなど, 多くの遺伝子工学用語を毎日のように見聞きしてきました. これらの用語はすべて, いわゆる生体分子でできている, あるいは生体分子に関連するものです. 多くの生体分子は, 遠心分離機を使って, 沈降係数で特徴づけることができます. この研究の先駆者は, スウェーデンの化学者 Theodor Svedberg 氏で, 彼は分散系の研究で1926年にノーベル賞を受賞しています. 彼の姓の頭文字が沈降係数 (S, svedberg) の単位名になっており, ある力 (重力または遠心力) のもとで粒子がどれだけ早く終端速度に達するかを表しています. 例えば, 完全な真核生物のリボソームの沈降係数は80 S です.
新型コロナウイルスは自然病と考えられていますが, 大気汚染など, 工場や自動車などの人工物や汚染源から排出される様々な大きさ (ナノメートルからミクロン) の粒子 (一般的には金属) が原因で起こる人工病もあります. 毒性学は, これらの粒子が人間の健康にどのように有害であるかを研究する分野です. 線量測定は, 生体内 (動物実験) と 生体外 (細胞ベースのアッセイ) の結果の不一致を説明する重要な技術の一つです. 粒子のドーズと濃度をより正確に定量化および予測することは, より正確な 生体内 実験に貢献すると期待されています. そのために, 沈降実験とシミュレーションが利用されているのです.
生物医学の研究において, 血液沈降は人体の炎症を研究するために使用されています. 沈降速度が速いほど炎症が強いことを意味し, また多発性骨髄腫のように異常なタンパク質の産生を特徴とする特定の疾患の指標となります. また, 沈降は, 白血球, 赤血球, 血小板の分離にも使用されます. 製薬用途では, 晶析後の母液からの薬物分離や, 他のタンパク質材料からのインスリン精製に用いられています (例えば, 製薬産業における遠心分離に関する総説). また, 医薬品の吸着, 脱着に関する研究も製薬業界にとって重要です.
非常に重要なアプリケーションの多くは, 沈降を使用します. 沈降や遠心分離は比較的簡単かつ迅速に実験できますが, 材料や条件の組み合わせを一度に多数シミュレーションできるコンピュータを使うことが絶対的に有利です. また, 吸脱着などの複雑な沈降現象を理解するためには, 数学的モデリングが不可欠な場合が多いです.
重力下での試験管を使用した沈降の方程式
生物工学, 遺伝子工学, 医療工学, および製薬用途では, 超高速遠心分離機を使用して粒子または分子を分離します. これは, 生体分子が他の種類の粒子よりも粘着性が高く, 沈降に大きな力が必要であることが主な理由です. (DNA/RNA を含む生体物質がどれほど粘着性があるか, 想像してみてください. 地球と太陽の距離の90倍の長さが, 1対の DNA 鎖の中に絡み合って詰まっているのです.) 市販の遠心分離機には7万 g (重力の単位) も発生させることができるものもあります. また, 水平に回転する試験管にレーザー光源を当てて, リアルタイムに濃度を測定するタイプの遠心分離機もあります.
遠心分離機による沈降を記述する支配方程式は, Lamm 方程式と呼ばれます. Ole Lamm 氏は Svedberg 氏の博士課程の学生でした. この方程式は単純に, このブログで取り上げている Mason–Weaver 方程式の円筒座標版です.
生体分子と比較すると, 毒性研究用の粒子 (一般的には金属やセラミックス) ははるかに重く, すぐに沈みます. このような用途では重力が働いてくれるということです. 下図のように, 試験管を垂直に置くと, 粒子は垂直に沈みます.
垂直位置を1D の x 座標に変換し, 管の長さ x_2 と計算時間 T が与えられたとき, 次の Mason–Weaver 方程式が得られます.
ここで, c は求解すべき変数である粒子濃度, A と B はそれぞれ粒子の拡散係数と沈降速度, g は重力加速度です.
管の上部と下部の境界条件は, いわゆるゼロ流束境界条件, すなわち次のようになります.
この条件は, 境界上の総質量流束 (拡散流束だけでなく) がゼロであること, つまり, 沈降粒子は試験管から出られないため, 底に溜まることを意味します. 私たちが主に知りたいのは, 粒子の蓄積された質量です. 計測のために, 仮想の体積 (1D のセグメント) を設定する必要があります. 上図では, このために区間 [x_1. x_2] が用意されています. 計算された蓄積質量は, 区間の大きさによって変化することに注意してください.
初期条件は, 一般的に以下のような一様分布となります.
ここで, c_0 は定数関数です.
これで, 沈降をシミュレーションするための定式化はすべて揃いました.
Mason–Weaver 方程式は, 極めて速い沈降の場合を除けば, わかりやすく解きやすい方程式です. この式が物理的に何を意味するのか, 見ていきましょう. まず, これは二つの方程式からできています.
- 拡散 (第2項)
- 重力による対流 (第3項)
この式の解釈は, それぞれの現象を別々に想像してみると非常に簡単です. 重い粒子はほとんど拡散することなく速やかに沈み, 試験管の底に溜まります. 最初は, 粒子は均一に分布しています. 沈殿が始まると, 上部から粒子が消え, 底部付近で粒子の数が増えていきます. 最後には, ほとんどすべての粒子が底にあります. つまり, 濃度関数は試験管の底でデルタ関数のようになります. 軽い粒子は重力の影響を受けないため, 溶液中に浮く傾向があります. この2つの現象は, 現実には同時に起こっています. 次のアニメーションは, 例として2つの極端なケースを示しています.
重い粒子 (左) と軽い粒子 (右) の空間濃度プロファイルの比較.
粒度分布のある粒子の沈降アプリ
上の図は比較的単純なものです. しかし, 現実の世界では, 一般に粒子は溶液中に個々に浮遊することはなく, 表面の電荷や粒子が持つ何らかの結合機構によって, 異なる大きさの凝集体を作ることが一般的です. 溶液中では, 上のアニメーションで見たように, 異なる大きさの凝集体は異なる動作をします. したがって, 全体の濃度プロファイルがどのように見えるかを想像するのは, もはや容易ではありません. 単一の粒子径に対する Mason–Weaver 方程式は, COMSOL Multiphysics® ソフトウェアのユーザーインターフェース (UI) にある偏微分方程式 (PDE) インターフェースを使用すれば簡単にシミュレーションできますが, 粒度分布やその他の条件や制約を考慮しなければならない, より実用的なケースをシミュレーションすることは簡単ではありません. そのような場合, アプリを作ることでより柔軟性が増し, より満足のいく結果を得ることができます.
以下のセクションでは, 参考とした DeLoid 氏の論文と同じ結果を再現するアプリを作成するための重要な手順の一部 (全てではない) をご紹介します.
ステップ1
モデルビルダーで, ジオメトリ, 材料, 基本的な物理量, 初期条件と境界条件を設定.
試験管を表す1D のジオメトリ (左がキャップ, 右が底部).
古典的 PDE インターフェースの安定化移流拡散方程式インターフェースを用いた Mason–Weaver 方程式の設定.
初期条件 (一様分布).
境界条件 (反射型境界条件).
ステップ2
アプリケーションビルダーで独自の UI を作成.
複数のリボンボタン (上), パラメーター設定ウィンドウ (左), 粒子サイズ分布プロファイル (右上), 結果グラフィックスウィンドウ (右下) を含む, 自作アプリの UI.
ステップ3
Java® コードを記述.
Java メソッドに関連付けられたインポートボタンを含むフォームの一部. ファイルから粒子サイズ分布データを読み込み, 配列2D 文字列に格納.
更新された粒子サイズごとに実行を繰り返すメインの for-end ループ用の Java メソッド. 底部の粒子質量を各時間ステップで粒子サイズごとに計算し, 配列2D 倍精度 (図示なし) に保存. 実行の最後に, 粒子質量を合計し, 底部に蓄積する総質量分率を計算.
以上の手順で作ったこのアプリを使用すると, 例えば以下のような最終結果になります. この例で使用した粒子は CeO2 で, 比較的重いため, 下のプロット (青線) に示すように, すぐに沈んで底に溜まる傾向があります. 粒子サイズは質量分率に大きく影響します. 小さな粒子は拡散によって浮き上がりやすく, 完全に沈むことはありません. その結果, 粒子サイズ分布を考慮すると, 質量分率は100%以下となり, より緩やかに平衡に到達します.
単一の粒子径 (UI の前図に示した分布プロファイルの平均半径 491 nm) と粒子サイズ分布の場合の比較 (COMSOL Multiphysics と参考文献はよく一致しています). 粒子: CeO2. 試験管の長さ: 10 mm. 底部の長さ: 10 um.
備考
係数 A と B は実験的に与えるか, または流体力学から導かれる以下の関係によって, 材料特性から計算することもできます.
ここで, k_B, \ T, \ \eta, \ r はそれぞれボルツマン定数, 温度, 溶液の動粘性係数, 粒子の半径であり, \rho_e, \rho_s はそれぞれ粒子の有効密度, 溶液の密度を表します.
このアプリを拡張するために, 機能を変更または追加したりすることもできます. 製薬や生物医学の用途では, 粒子の溶解性を考慮するとよいでしょう. 下部境界では, 反射境界条件の代わりに, 吸着と脱離を考慮した別の境界条件を検討することをおすすめします. これらの拡張は, 補助方程式を追加することで実行できます. Christmann, Ramteke, Dokoumetzidis による参考文献を参照してください.
次のステップ
このブログで取り上げた沈殿アプリは, 以下のボタンをクリックしてお試しいただけます. 独自のアプリを作成するためのインスピレーションとして使用して, コメントでご感想などお知らせください!
参考文献
- G.M. DeLoid et al., “Advanced computational modeling for 生体内 nanomaterial dosimetry”, Particle and fibre toxicology, vol. 12, no. 1, pp. 1–20, 2015.
- K. Christmann, Introduction to Surface Physical Chemistry, Springer Science & Business Media, vol. 1., 2013.
- K.H. Ramteke et al., “Mathematical models of drug dissolution: a review”, Sch. Acad. J. Pharm, vol. 3, no. 5, pp. 388–396, 2014.
- A. Dokoumetzidis and P. Macheras, “A century of dissolution research: from Noyes and Whitney to the biopharmaceutics classification system”, International Journal of Pharmaceutics 321.1-2 (2006): 1–11.
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